امتیاز : -3

فهرست مطالب

چکیده ۴

مقدمه ۶

مورفولوژی ، آزمایشی بیوشیمیایی و رشد باکتری ها ۸

تحلیل و آنالیز اسیدهای چرب و PHA 9

ایزولاسیون انضمام لیپیدی ۱۰

میکروسکپی الکترونی ۱۱

نتایج ۱۲

شکل گیری مجموعه های انضمام یا ضمائم لیپیدی ۱۳

رابطه بین دما برای رشد و سنتز PHA 14

رخداد پلی فسفات ۱۵

مشخصات ایزوله ۲۱۱ ۱۵

ایزولاسیون و مشخصات شیمیایی ضمائم لیپیدی A. 16

تحلیل و آنالیز الکتروفورز ژل ضمائم لیپیدی ناشی از A. 17

 

چكيده

چهل باكتري دريايي (آبزي) استفاده كننده از روغن خام سايكر و تروفيك يا سايكرو تروفيك يا سايكروتروفيل (به ترتيب Psychrophile , Psychrotrophic (كه ‌اولي ‌نوشته مي شوند) براي توانشان جهت تراكم سازي تركيبات نگهداري ليپيدشان در سيتوپلاسم در طي پرورشي تحت شرائط محدود كنندة نيتروژن،‌مورد تحقيق و بررسي قرار گرفتند. بيشترشان (73%) قادر به تراكم سازي ليپيدهاي عظيمي نظير اسيدهاي پلي هيدروكسي آلكانوئيك (PHA) بودند در حاليكه ديگر ليپيدها همانند استيرهاي واكسن (موم) در دو ايزوله رخ مي دادند. تراكم يا انباشتگي يا توده شدن PHA بطور غالب در دورهاي پائين   20-4 ) طبق آنچه براي سه ايزوله نشان داده شد، رخ داد. ميكروسكوپي الكتروني ضخائم پلي فسفات را كه در دو ايزوله براي PHA رخ مي دهد، آشكار كرد. سلولهاي(1) Acineto bacter sp  (منبعد بصورت “A” مي آيد) ايزوله ، قادر به سنتز كردن و تراكم نمودن ضمائم ليپيدي در طي رشد بر استارت،‌اتانول،‌روغن زيتون ،‌هگزاد گانول و هپتادكان بودند. تركيب و كمپوزيسيون ضمائم ليپيدي بر تركيبات فراهم شده بعنوان منبع مركزي ،‌بستگي داشتند. (سيترهاي واكسن (موم = Wax ) واكيل گليسرول ها اساساً در طي پرورش بر روغن زيتون رخ مي دادند و در مقابل استرهاي واكسن يا مومي و الكل هاي آزاد در طي پرورش بر هگزاد كانول رخ مي دادند. كل اسيدهاي چرب در سلولهاي A  بالغ  بر ميزاني تا 25% از وزن خشك سلولي در سلولهاي رشد يافته بر روغن زيتون مي شدند. اسيد پالميتيك (Palmiticacid) اسيد چرب اصلي در ليپيدها در طي پرورش بر هگزاكانون ،‌هپتا دكان يا روغن زيتون رخ مي دادند به منبع كربن مرتبط بودند. (اسيدهاي چرب حاضر در ليپيدهاي تراكم، بگونه اي غالب و محاط از اسيدهاي چرب باز غده مستقيم اشباع شده و اشباع نشده با طول زنجيره متغير از 12 تا 18 اتم كربن ،‌تشكيل مي شدند. تحليل و آناليز پروتئين هاي توأم با ليپيد دانه در سلولهاي A پروتئين  

Kda 39 را بعنوان گونه پروتئيني غالب آشكار و واضح ساختند.

 

مقدمه:

شرايط محيطي (محيط زيست) كه در ساحل خليج (در آرژانتين)‌ San Jorge رخ ميدهند، با دماي آب دريا تقريباً   5 و   15 ( به ترتيب) در فصول زمستان و تابستان و با درجه بالاي آلودگي بواسطه نفت خام در برخي محلها با اين اكوسيستم را براي ايزولاسيون ميكروارگانيسم هاي و سايكروتروفيك و سايكروفيك (‌كننده در هيدروكربني مطلوب مي سازد. چنين ارگانيسم هاي منطبق شده با سرمايي قادر به بقا و قادر به رشد در محيط هاي سرد بوده كه در بيشتر اكوسيستم هاي دريايي بوقوع مي‌پيوندند. اينكه جمعيت ميكربي محيط هاي دريايي اغلب در معرض ديگر شرائط همانند موجوديت مواد مغذي قرار مي گيرند. ميكروارگانيسم ها انوع استراتژي هايي كه اجازه بقايشان در اين محيط هاي متغير را مي دهند توسعه مي دهند كه تراكم نگهداري ليپيدها ‌يكي از انها است. تركيبات نگهداري بطور نرمان بصورت ضمائم فوق سلولي در باكتري ها رخ مي دهند.

تراكم ضمائم ليپيدي توسط يك ايزوله در طي رشد بر انواع طبقات فرعي مي پردازيم

مواد و روش ها : منبع ميكروارگانيسم ها ،‌محيط ها و روش غني سازي

رشته هاي بكار رفته در اين مطالعه از نمونه هاي آب دريايي سطحي كه از روغن خام استفاده مي كند (بعنوان تنها منبع كربني) غني شده و ايزوله شده است. نمونه ها از ساحل خليج San Jorge در آرژانتين در طي دسامبر 199 و ‌1993 جمع آوري شدند.

دماهاي نمونه ها بين   5 و   15 متغير بودند يك كلكتور يا گيرنده فلزي گرفته شده و در تمام اوقات در يخ حمل و نقل مي شدند. تقريباً mml5 آب دريا توسط كليتراسيون از طريق يك فيلتر استريل غشايي با اندازة‌روزانه   45/0 ،‌متراكم و كنسانتره شد. كنسانتره به سالين فيزيولوژيكي استريل ml50 اضافه شد و هم زده شد.

محيط معدني (MSM) بنا به Schlege etal با ml5 از اين سو از اين سوسپانسيون آغشته شد (تلقيح شد) . پس از 7-5 روز از زمان تلقيح يا آغشته شدن در   7 اين كشت جهت آغشتگي يا تلقيح پليت هاي Msu/agar بكار رفت كه حاوي روغن خام بعنوان منبع كربن بود و پليت ها در   7 و   20 آغشته شد. (از ‌براي خلوص رشته هاي در حال رشد استفاده شد.

 

مورفولوژي ، آزمايشي بيوشيميايي و رشد باكتري ها :

ايزوله ها جهت كسب شناخت و هويت رده بندي مقدماتي تحليل و آناليز شدند. آزمايشات و رده بندي ها بصورت زير است: شكل سلول، شكل كلني و رنگ Gramstian ، Catalase اكسيداز، تست of اصلاح شده Liefsen و آزمايش API20E ايزوله 211 در DSMZ وارد شد كه هويتش بعنوان يك گونه از  را تأييد كرد و شماره كلكسيون 11042DSMZ را بدست آورد. سلولها بصورت هوازي در   4 يا  20 در محيط  (گوشت) غذايي يا محيط نمكهاي معدني رشد يافتند كه با 2% كلرايد سديم و منبع كربن مربوطه تكميل شد. جهت مجاز داشتن تراكم ليپيدها، غلظت و تراكم كلرايد آمونيوم در محيط معدني تا 05/0% كاهش يافت. جهت كسب محيط جامد شده 8/1% agar اضافه شد. براي بررسي ميكروسكوپي ضمائم ليپيدي سلولها با B  سياه Sudan با بكارگيري سفرانين بنا به Burdon مورد مطالعه قرار گرفتند. كل فسفات توسط آزمايش اسپكترومتري طبق شرح Watanabe folsen تحليل و آناليز شد.

عصاره گيري (استخراج) ليپيد و كروماتوگرافي لايه نازك (TLC)

جهت تعيين كردن هويت ليپيدها TLC با نمونه هاي كل سلولهاي استخراج شده با تركيبي از متانول – كلرو فرم اجرا شد. كروماتوگرافي بر پليت هاي ژل سيليس 60 اجرا شد كه سيستم هاي حلال زير را بكار گرفتند. اسيد استيك / اتر دي اتيل / هگزان . 

كسرهاي ليپدي توسط بخار يد قابل رويت بودند. عناصر مرجع زير بكار گرفته شدند. اسيد پالميتيك ،‌اسيد استريك دي پالميتين تري پالمتيين ، گليسرول rac ميوسيتويل – دي پالميتويل – آوا – ستيل پالمتيت و 

1- هگزاد كانول

تحليل و آناليز اسيدهاي چرب و PHA

جهت تعيين محتواي PHA يا اسيد چرب سلولها و تركيب مواد نگهداري اسيدهاي چرب يا پلي استرها به اسيد چرب تشكيل دهنده تغيير شكل يافتند. اين اسيترها توسط كروماتوگرافي گازي با يك كروماتوگراف گازي مجهز يه ستون ‌MX25 Permaphase PEG و يك ردياب يونيزاسيون شعله مورد تحليل قرار گرفتند. نسبت   2 فاز ارگانيك پس از تقسيم تزريق تحليل شد. هليوم بعنوان گاز حامل بكار رفت . دماهاي انژكتور و ردياب   230 و   275 بودند. يك برنامه دمايي براي جدايي كارآمد استرهاي متيل بكار رفت. به انضمام رديابي استرهاي متيل اسيدهاي هيدروكسي آلكانوئيك اين روش هم چنين اجازه رديابي اسيدهاي آلكانوئيك – n با 18-7 اتم كربن را مي داد. اسيدهاي چرب توسط قياس مقادير RF اسيدهاي چرب استاندارد مربوطه شناخته شدند. براي تحليل كمي اسيد ‌يا اسيد تري دكانوئيك و اسيد تترادسنوئيك بعنوان استانداردهاي داخلي بكار رفتند.

ايزولاسيون انضمام ليپيدي:

انضمام يا ضمائم ليپيدي توسط سانتري فوژ كردن در گراديانهاي چگالي بنا باد Preastiny etal ايزوله شدند. سلولها در MSM با روغن زيتون بعنوان تنها كربن تحت شرائط محدودگر نيتروژن بمدت 96-72 ساعت در محيط ml 1000-500 پرورش يافته و سپس توسط سانتري فوژ كردن برداشت شده و در TRIS/HCL مجدداً معلق شدند. پس از عبور سه گانه از يك  ‌فرانسوي (Prench) ، عصاره هاي بدون سلول بدست آمدند و ml 3-2 برا بالاي يك گراديان ساكاز و زلود شد. گراديانهاي ساكاروز مقطع از هر ml 2 از 3/0 و 6/0 و 2/1 و M 2 ساكاروز در TRIS/HCL مهيا شدند. گراديان در  4 بمدت 5 ساعت در g 170000 سانتري فوژ شد. دانه ها يا گرده ها از گراديانها جمع آوري شده و متعاقباً توسط 20 دقيقه سانتري فوژ كردن شسته شدند. ضمائم متعاقباً در معرض تحليل شيميايي و سولفات ‌سديم قرار گرفتند.

الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد و تعيين كردن اسيد آمينه  ترمينال

ضمائم ايزوله شده در بافر لور كننده ژل معلق شدند كه حاوي 6/0% از SDS ، 25/1 % از 2- مركاپتواتانول و mm 25/0 ‌Edta و 10% گليسرول و 001/0% بروموفنول آبي در mm 25/1 از TRIS/HCL بود. پروتئين ها ‌شده و از دانه ها توسط تلقيح يا آغشتن 5 دقيقه اي در  100 رها شدند. پروتئين ها در ژل c 1% Sds/polyacylamid رها شدند طبق شرح Laemmli  و با آبي روشن Coomassie ، “A” طبق تشريح osborn و  Weber  يا توسط روش لكه گذاري نقره اي طبق تشريح Dernick و Heukeshofen لكه دار شدند. باندياتوار ارائه گر پروتئين Mr 39000 جدا شد و رشته اسيد آمينه –N ترمينال توسط تنزل Edman خودكار شده تعيين شد.

ميكروسكپي الكتروني

سلولهايي كه شسته شده و در بافر فسفات پتاسيم mM 50 معلق شدند با گلوتار آلدئيد ثابت شده و در رزين با ديسكازيته اندك Spurr گنجانيده شد كه طبق شرح Watheer – uanruschtetal است. بخشهاي نازك ‌سرب كنتراست داده شده و دريك ميكروسكوپ الكتروني فيليپس در بزرگنمايي هاي كاليبره شده، بررسي شدند.

  گزارش تخلف  |  افزودن به فایل های من | maghale33 | تاریخ ارسال : 15 /06 /1395

شما هم می توانید در مورد این فایل نظر دهید.